Urutan genom sebagian besar virus telah diketahui.Probe asam nukleat yang merupakan segmen pendek DNA yang dirancang untuk berhibridisasi dengan DNA virus komplementer atau segmen RNA.Reaksi berantai polimerase (PCR) adalah teknik yang lebih efisien untuk deteksi virus.Metode diagnostik throughput tinggi telah dikembangkan baru-baru ini.
A. Teknik hibridisasi asam nukleat
Hibridisasi asam nukleat, terutama termasuk blotting Selatan (Selatan) dan blotting Utara (Utara), adalah teknik baru yang berkembang pesat di bidang diagnostik virus.Dasar pemikiran dari uji hibridisasi adalah menggunakan segmen pendek DNA (disebut "probe") yang dirancang untuk berhibridisasi dengan segmen DNA atau RNA virus komplementer.Dengan pemanasan atau perlakuan basa, DNA atau RNA target untai ganda dipisahkan menjadi untai tunggal dan kemudian diimobilisasi pada penyangga padat.Setelah itu, probe ditambahkan dan dihibridisasi dengan DNA atau RNA target.Karena probe diberi label dengan isotop atau nuklida non-radioaktif, DNA atau RNA target dapat dideteksi melalui autoradiografi atau dengan sistem biotin-avidin.Karena sebagian besar genom virus telah dikloning dan diurutkan, mereka dapat dideteksi menggunakan sekuens spesifik virus sebagai probe dalam spesimen.Saat ini, metode hibridisasi meliputi: dot blot , hibridisasi in situ dalam sel , DNA blotting (DNA) (Southern blot) dan RNA blotting (RNA) (Northern blot).
Teknologi B.PCR
Dalam beberapa tahun terakhir, serangkaian teknik amplifikasi asam nukleat in vitro telah dikembangkan berdasarkan PCR, untuk menguji virus yang tidak sensitif atau tidak dapat dibudidayakan.PCR merupakan suatu metode yang dapat mensintesis sekuens DNA spesifik melalui reaksi polimerase in vitro.Proses PCR mencakup siklus termal dari tiga langkah: denaturasi, annealing, dan ekstensi Pada suhu tinggi (93℃~95℃), DNA untai ganda dipisahkan menjadi dua untai DNA tunggal;kemudian pada suhu rendah (37℃~60℃), dua primer nukleotida yang disintesis menyatu dengan segmen DNA komplementer;sedangkan pada suhu yang sesuai untuk enzim Taq (72℃), sintesis rantai DNA baru dimulai dari ujung 3' primer menggunakan DNA komplementer sebagai cetakan dan nukleotida tunggal sebagai bahan.Jadi setelah setiap siklus, satu rantai DNA dapat diamplifikasi menjadi dua rantai.Mengulangi proses ini, setiap rantai DNA yang disintesis dalam satu siklus dapat digunakan sebagai cetakan pada siklus berikutnya, dan jumlah rantai DNA digandakan dalam setiap siklus, yang berarti produksi PCR diperkuat dalam kecepatan log 2n.Setelah 25 hingga 30 siklus, produksi PCR diidentifikasi melalui elektroforesis, dan produk DNA spesifik dapat diamati di bawah sinar UV (254nm).Untuk keuntungan spesifisitas, sensitivitas, dan kemudahannya, PCR telah diadopsi dalam diagnosis klinis banyak infeksi virus seperti HCV, HIV, CMV, dan HPV.Karena PCR sangat sensitif, dapat mendeteksi DNA virus pada tingkat fg, operasi harus dilakukan dengan sangat hati-hati untuk menghindari positif palsu.Selain itu, hasil positif dalam uji asam nukleat tidak berarti ada virus infeksi hidup dalam sampel.
Dengan penerapan teknik PCR yang luas, teknik dan metode baru dikembangkan berdasarkan teknik PCR untuk tujuan pengujian yang berbeda.Misalnya, PCR kuantitatif waktu nyata dapat mendeteksi viral load;in situ PCR digunakan untuk mengidentifikasi infeksi virus dalam jaringan atau sel;Nested PCR dapat meningkatkan spesifisitas PCR.Diantaranya, PCR kuantitatif real time telah berkembang lebih pesat.Banyak teknik baru, seperti probe hidrolisis TaqMan, probe hibridisasi, dan probe suar molekuler, telah digabungkan menjadi teknik PCR kuantitatif waktu nyata, yang banyak digunakan dalam penelitian klinis.Selain mengidentifikasi viral load dalam cairan tubuh pasien secara akurat, metode ini juga dapat digunakan untuk mendeteksi mutan yang toleran terhadap obat.Oleh karena itu, PCR kuantitatif waktu nyata terutama diterapkan dalam evaluasi efek kuratif dan pengawasan toleransi obat.
C. Deteksi asam nukleat virus dengan throughput tinggi
Untuk memenuhi kebutuhan diagnosis cepat penyakit menular baru yang muncul, berbagai metode deteksi throughput tinggi, seperti chip DNA (DNA), telah ditetapkan.Untuk chip DNA, probe spesifik disintesis dan dilekatkan pada chip silikon kecil dengan kepadatan sangat tinggi untuk membentuk DNA probe microarray (DNA) yang dapat dihibridisasi dengan sampel.Sinyal hibridisasi dapat dicitrakan dengan mikroskop confocal atau pemindai laser dan diproses lebih lanjut oleh komputer dan kumpulan data besar mengenai gen yang berbeda dapat diperoleh.Ada dua jenis chip DNA."Chip sintesis" adalah sebagai berikut: oligonukleotida spesifik disintesis langsung pada chip.Lain adalah chip DNA pool.Gen kloning atau produk PCR dicetak secara teratur pada slide.Keuntungan dari teknologi chip DNA adalah deteksi simultan dari sejumlah besar urutan DNA.Versi terbaru dari chip pendeteksi patogen dapat mengidentifikasi lebih dari 1700 virus manusia sekaligus.Teknologi chip DNA memecahkan masalah metode hibridisasi asam nukleat tradisional dan memiliki aplikasi yang sangat luas dalam diagnosis virus dan studi epidemiologi.
Waktu posting: 23 Des-2020